SOAL UJIAN KULIAH KULTUR JARINGAN

UJIAN AKHIR SEMESTER

MATA KULIAH KULTUR JARINGAN

Petunjuk:

1.    Kerjakan semua soal pada Bagian A dan 2 soal pada Bagian B.

2.    Jawaban dikumpulkan pada hari Jumat tanggal 9 Januari 2015, sebelum pukul 15:00 WIB.

SOAL BAGIAN A:

1)   Dari semua tahapan micro-propagation: (a). Tahap yang manakah yang paling sulit dilakukan? Mengapa Saudara berpendapat demikian? (b). Tahap yang manakah yang paling mudah dilakukan? Mengapa Saudara berpendapat demikian?

2)   Inisiasi kultur merupakan salah satu titik kritis dalam propagasi tanaman secara in vitro. Lakukan analisis terhadap hasil inisiasi dimana: (a). eksplannya hidup akan tetapi tidak tumbuh; (b) eksplannya mati akan tetapi tidak terjadi kontaminasi.

3)   Sebagai tahap akhir dalam perbanyakan tanaman secara in vitro, aklimatisasi memegang peranan penting terhadap perbanyakan tanaman secara in vitro. (a). Lakukan analisis mengapa langkah aklimatisasi dapat mengalami kegagalan? (b). Apa yang Saudara sebaiknya lakukan untuk menghindari kegagalan saat aklimatisasi plantlet?

4)   Sebagai pemilik PT. Super Seed yang menjual benih kentang dalam bentuk plantlet, Anda mendapat email dari salah satu pelanggan bahwa sebagian benih yang dibeli dari Lab Saudara telah terjangkit virus. (a) Bagaimana Saudara membuktikan bahwa benih-benih yang Saudara jual sebenarnya terbebas dari virus jenis apa pun? (b). Jika ternyata benih tanaman kentang Saudara memang terinfeksi virus, bagaimana Saudara dapat membebaskan virus itu? Jelaskan.

SOAL BAGIAN B: Saudara harus membaca jurnal untuk menjawab pertanyaan di bawah ini.

a)    Konservasi. Berikan alasan mengapa Konservasi plasmanutfah perlu dilakukan; Ceritakan metode konservasi eksplan tanaman nanas sehingga eksplan itu dapat disimpan lebih dari 6 bulan tanpa mengalami kerusakan.

b)   Fusi Protoplast. Berikan alasan mengapa Fusi Protoplast harus dilakukan; Ceritakan bagaimana teknik Fusi Protoplast ini dilakukan? Dan, apa kelebihan teknik ini dibandingkan teknik hibridisasi dalam teknik pemuliaan tanaman.

c)    Embrio Rescue. Berikan alasan mengapa Embrio Rescue harus dilakukan; Bagaimana melakukannya, dan berikan contoh komoditasnya.

d)   Kultur Anthera. Berikan alasan mengapa Kultur Anthera perlu dilakukan; Bagaimana melakukannya? Dan Berikan contoh komoditasnya.

e)    Seleksi in vitro untuk meningkatkan ketahanan tanaman kentang terhadap cekaman suhu tinggi. Berikan alasan mengapa seleksi in vitro ini perlu dilakukan. Ceritakan bagaimana metode melakukannya.

f)    Seleksi in vitro untuk meningkatkan ketahanan tanaman kentang terhadap cekaman kekeringan. Berikan alasan mengapa seleksi in vitro ini perlu dilakukan. Ceritakan bagaimana metode melakukannya?

g)   Berikan alasan mengapa seleksi in vitro ini perlu dilakukan. Berikan alasan mengapa teknik ini harus dilakukan; Ceritakan bagaimana teknik ini dilakukan; dan berikan contoh komoditasnya?

h)   Seleksi in vitro untuk meningkatkan ketahanan tanaman terhadap cekaman salinitas. Berikan alasan mengapa seleksi in vitro ini perlu dilakukan. Ceritakan bagaimana metode melakukannya. Dan, berikan contoh komoditasnya.

Penyelesaian!

Soal A

1.    Jawaban soal nomor 1

Tahapan-tahapan pada proses mikropropagasi yaitu Tahap 0: tahap persiapan (preparasi) Tahap 1: tahap induksi (pemacuan) Tahap 2: tahap multiplikasi (perbanyakan) Tahap 3: tahap pengakaran Tahap 4: tahap transplantasi (pemindahahan) ke media terrestrial.

a.    Menurut pendapat saya tahapan yang paling sulit dilakukan adalah tahap 1 yaitu tahap induksi (pemacuan) karena tahap awal ini sangat penting dan menentukan bagi keberhasilan mikropropagasi. Pada tahap ini eksplan dan media yang digunakan harus dalam keadaan aseptik atau terbebas dari kontaminan (virus, bakteri dan fungi). Selain itu, tahap ini merupakan tahap yang paling rentan terhadap kegagalan yang diakibatkan karena eksplan atau media yang tidak aseptik sehingga menyebabkan kontaminasi.

b.    Sedangkan tahap yang paling mudah dilakukan adalah tahap 2 dan tahap 3. Alasannya karena kedua tahap tersebut merupakan tahapan sub kultur yaitu memindahkan eksplan dari tahap 1 kemedia lain sehingga resiko kegagalannya sangat kecil.

2.    Jawaban soal nomor 2

a.    Misalkan analisis dilakukan pada eksplan pisang. Faktor-faktor yang menyebabkan eksplan pada pisang hidup akan tetapi tidak tumbuh adalah sebagai berikut:

ü Formulasi media yang digunakan tidak cocok, misalkan ZPT yang digunakan tidak cocok.

ü Tanaman tersebut hidup tapi kontam, disebabkan oleh :

§  Alat yang digunakan pada saat melakukan inisiasi tidak steril yang menyebabkan adanya patogen pada alat tersebut sehingga menempel pada eksplan yang akan ditanam dan akhirnya terjadi kontaminasi.

§  Karena ada bahan tanam yang sulit disterilkan, seperti pisang, jahe, gladior, umbi talas, kentang dan umbi jalar. Hal ini dikarenakan bahan tanam tersebut ditanam ditanah sehingga banyak mengandung patogen.

§  Bahan tanam yang digunakan berupa daun tetapi tidak mulus atau banyak bulu yang menyebabkan desinfektan yang diberikan tidak dapat menembus bagian daun karena terhalang oleh bulu tersebut.

§  Desinfektan yang digunakan tidak cocok atau tidak tepat (waktu, jenis ataupun konsentrasinya).

b.    Penyebab dari eksplan mati akan tetapi tidak terjadi kontaminasi adalah karena bahan tanam atau eksplan yang digunakan mengeluarkan getah sehingga media berubah warna menjadi coklat (browning) dan terjadi proses oksidasi senyawa polifenol/fenol yang menyebabkan proses penyerapan hara oleh tanaman menjadi terhambat dan lama kelamaan tanaman akan mati.

3.    Jawaban soal nomor 3

a.    Karena pada tahap aklimatisasi :

ü Planlet dipindahkan dari kondisi heterotrof menjadi autotrof. Kondisi heterotrof artinya hidup dari bahan organik yang disuplai ke dalam media tumbuh, sedangkan autotrof artinya hidup dari bahan-bahan anorganik dalam media. Pada kondisi autotrof ini menyebabkan penyerapan nutrisi pada planlet menjadi terganggu dan beresiko terhadap kematian planlet.

ü Pemindahan planlet dari lingkungan yang terkontrol (aseptik) ke kondisi lingkungan tak terkendali, baik suhu, cahaya, dan kelembaban yang menyebabkan cekaman lingkungan terhadap planlet itu sendiri.

ü Faktor yang menyebabkan kegagalan pada tahap aklimatisasi adalah kekeringan.

b.    Hal yang dapat dilakukan agar proses aklimatisasi dapat berhasil yaitu :

ü Dengan memberikan perlakuan pada saat tanaman masih berada didalam botol kultur dengan retardant agar planlet dalam keadaan gemuk dan toleraan terhadap kekeringan.

ü Memberikan perlakuan setelah tanaman dikeluarkan dari botol, dengan cara diberikan mikoriza untuk memudahkan tanaman menyerap air dan nutrisi.

ü Jangan menggunakan media pasir, karena pasir tidak dapat menyimpan/mengikat air.

ü Dengan meciptakan suhu lingkungan yang rendah agar planlet tidak mengalami kondisi cekaman suhu.

ü Selain faktor tersebut hal yang dapat dilkukan untuk mencegah kematian plantlet akibat transpirasi adalah :

§  Dengan melakukan penyungkupan plantlet dengan plastik atau ditempatkan diruangan dengan kelembaban tinggi.

§  Dengan memberikan suhu ruangan dan diletakkan ditempat yang ternaungi dengan intensitas cahaya 30 %.

§  Pada kasus tertentu, daun tanaman disemprot dengan anti transpirant (misalnya Abscicic acid) untuk mencegah penguapan yang terlalu besar dari daun.

§  Secara perlahan, kelembaban dikurangi dan intensitas cahaya ditambah untuk merangsang fotosintesis.

4.    Jawaban soal nomor 4

a.    Hal yang akan saya lakukan untuk mengetahui apakah benih kentang tersebut terbebas dari virus atau tidak adalah dengan melakukan virus indexing, virus indexing berfungsi untuk mendeteksi apakah pada bahan tanam yang akan diperbanyak mengandung virus atau tidak. Karena benih yang akan diperbanyak harus zero virus atau terbebas dari virus agar tidak merugikan petani yang menanam benih tersebut.

b.    Jika benih kentang tersebut memang terinfeksi virus maka hal yang akan saya lakukan dengan melakukan teknik kultur jaringan. Karena dengan teknik kultur jaringan akan mengahsilkan tanaman yang terbebas dari patogen (virus, bakteri dan fungi) atau disebut dengan phatogen free seeds. Atau dapat juga dengan melakukan virus indexing dengan melakukan kultur meristem karena akan mengahsilkan tanaman yang terbebas dari virus.

Soal B

b.   Jawaban soal b

-     Alasan mengapa teknik fusi protoplasma perlu dilakukan karena :

ü Jika secara persilangan tidak bisa dilakukan.

ü Mengatasi tanaman yang incompatibilitas.

ü Dimungkinkan untuk persilangan secara luas yaitu antar spesies, antar kultivar atau antar genus dalam satu spesies.

ü Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan kualitas.

ü Potensi yang sangat besar untuk masa depan jika ingin memecahkan permasalahan yang sulit di masa kini.

ü Protoplas juga target untuk rekayasa genetika .

-     Prosedur fusi protoplasma secara umum adalah persiapan eksplan yaitu dengan menggunakan jaringan tanaman yang lebih muda. Sterilisasi eksplan yaitu dengan mencuci bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan, kemudian sterilisasi dengan menggubakan sodium hypoklorit 1 –  2 % selama 10 – 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Kemudian melakukan isolasi protoplasma, dengan metode mekanik dilakukan dengan cara mengupas dinding  sel menggunakan alat bedah mikro atau dengan metode enzimatik yaitu dengan menggunakan enzim selulose, hemiselulose dan pektinase yang akan menghancurkan dinding sel. Kemudian melakukan fusi protoplasma, dapat dilakukan secara kimia yaitu dengan menggunakan enzim polyethylene glycol (PEG) yang berfungsi sebagai bulking agent atau dengan cara elektroforesi yaitu dengan dialiri aliran listrik yang dilengkapi dengan generator AC dan DC. Kemudian melakukan pelaksanaan isolasi dan kultur protoplasma dan tahap terakhir adalah regenerasi protoplasma menjadi plantlet.

-     Teknik fusi protoplasma pada tanaman Solanum melongena (terung) dan Solanum torvum (takokak) sebagai berikut:

1.    Persiapan eksplan (Sumber Protoplas)

Eksplan yang digunakan adalah S.melongena dan S. torvum. Benih dari kedua species tersebut disterilkan dalam alkohol 70 %, kemudian dalam 0,05% HgCl2, dan 30 % clorox masing masing selama 3 menit. Setelah itu benih dicuci dengan aquades. Benih yang telah disterilisasi dikecambahkan dalam media MS + 20 g/l sukrosa dan 7 g/l agar. Media tersebut disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121^oC selama 20 menit. Setelah berkecambah, benih disubkultur pada media baru dan diinkubasi pada suhu 25-27^oC, dengan penyinaran 1000 lux selama 12 jam setiap hari. Satu bulan setelah pengkulturan daunnya digunakan sebagai sumber protoplas.

2.    Persiapan Larutan Enzim

Enzim yang digunakan adalah enzim Sellulase Onozuka RS 0,5 % (ml/l); 0,5 % (M/v) macerozyme R-10 (Yakult honssa Co.); 0,05% (M/v) MES dan 9,1 % (M/v) manitol. Senyawa tersebut dilarutkan dalam CPW dan pH diatur 5,5 – 5,6, dan disterilisasi dengan filter ukuran 0,22 µm. Larutan tersebut kemudian dimasukkan kedalam cawan petri berdiameter 5 cm, masing masing 5-6 ml setiap cawan.

3.    Isolasi Protoplas

Permukaan bagian bawah daun S.melongena dan S.torvum digores dengan pisau secara merata dengan jarak antar irisan 2-3 cm. Daun yang telah diiris ditempatkan dalam cawan petri yang berisi larutan enzim, kemudian diinkubasi dalam kamar gelap pada suhu 27^oC selama 16 jam. Untuk membantu melepaskan protoplas, cawan petri digoyang selama 30 detik sehingga diperoleh larutan protoplas. Larutan protoplas S.melongena dan S.torvum disaring dengan metalic sieve berukuran 100µm, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1800 rpm selama 5 menit sampai dihasilkan pelet. Kemudian larutan enzim dipisahkan dan protoplas dilarutkan dalam 21 % sukrosa dan disentrifugasi kembali selama 10 menit. Protoplas murni diambil menggunakan pipet dan disentrifugasi kembali. Kemudian protoplas dilarutkan dalam 0,5 M manitol + 0,5 mM CaCl2 dan disentrifugasi selama 5 menit sampai terbentuk pelet protoplas. Akhirnya protoplas dicuci dan densitas nya diukur.

4.    Fusi Protoplas

Protoplas S.melongena dan S torvum yang telah dimurnikan seperti tersebut diatas masing masing diencerkan dengan larutan pencuci sehingga densitasnya menjadi + 5 x 104 protoplas /ml. Kemudian suspensi protoplas dicampur dalam tabung reaksi dengan perbandingan volume yang sama dan diresuspensi sampai homogen. Setelah homogen suspensi protoplas diambil dengan pipet sebanyak 600-800 µl kemudian dimasukkan kedalam cawan petri berdiameter 5 cm dan dibiarkan selama 5 menit sehingga protoplas mengendap. Selanjutnya di sekeliling suspensi protoplas ditambahkan 100 µl larutan PEG dengan konsentrasi 30 % atau 50 % sebagai perlakuan selama 10 dan 20 detik untuk menginduksi terjadinya fusi. Larutan PEG kemudian dibuang dan protoplas dibersihkan dengan larutan pencuci. Selanjutnya dilakukan penghitungan secara mikroskopis terhadap protoplas yang mengalami fusi. Protoplas yang telah difusikan dikultur dalam media perlakuan untuk memacu pertumbuhannya.

5.    Kultur Protoplas Hasil Fusi

Media yang digunakan adalah media dasar KM8P dan VKM, masing masing diperkaya dengan 0,2 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l zeatin + 0,1 mg/l NAA dengan pH 5,8. Media tersebut disterilisasi dengan filter ukuran 0,22 µm. Masing masing medium dipipet dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi protoplas yang telah difusi, masing masing 6 ml setiap cawan. Kultur dipelihara dalam ruangan tanpa atau dengan penyinaran 1000 lux pada suhu 27^oC sampai terbentuk koloni sel atau mikrokalus. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah koloni sel dan mikrokalus yang dihasilkan.

6.    Pengenceran Suspensi (Koloni ) Sel

Untuk mendorong mikrokalus membentuk kalus, suspense sel diencerkan dengan media dasar yang sama (KM8P dan VKM), tetapi ZPT nya diganti dengan 0.1 mg/l 2,4-D + 2mg/l BAP. Koloni atau mikrokalus dari setiap cawan petri dibagi menjadi tiga, dan setiap bagian dimasukkan ke dalam cawan petri baru yang telah berisi media pengenceran masing masing 6 ml. Kultur disimpan kembali tanpa cahaya dalam inkubator bersuhu 27^oC. Lalu diamati jumlah kalus yang dihasilkan.

7.    Regenerasi Tunas

Kalus yang dihasilkan dari setiap perlakuan dipindahkan ke dalam media padat MS + vitamin Morell + 0,1 mg/l IAA dan konsentrasi Zeatin sebagai perlakuan (2,4 dan 6 mg/l). Kemudian diamati keberhasilan regenerasi kalus membentuk tunas. Tunas yang dihasilkan dipindahkan ke media dasar yang sama, yaitu MS + vitamin Morell (padat) tanpa menggunakan ZPT untuk induksi akar.

-     Kelebihan teknik fusi protoplasma dibandingkan dengan hibridisasi dan pemuliaan tanaman :

ü Menghasilkan tanaman dengan sifat tertentu dan dapat dilakukan dengan spesies yang berbeda.

ü Menghasilkan hibrid somatik amphidiploid yang fertil antar spesies yang secara seksual tidak kompatibel

ü Menghasilkan heterozigot dalam satu spesies tanaman yang secara normal hanya dapat diperbanyak dengan cara vegetatif, misalnya pada kentang.

ü Memindahkan sebagian informasi genetik dari satu spesies ke spesies lain dengan memanfaatkan fenomena yang disebut penghilangan kromosom (chromosome elimination).

ü Memindahkan informasi genetik yang ada di sitoplasma dari satu galur atau spesies ke galur atau spesies lain

ü Dapat dilakukan persilangan terhadap tanaman yang memiliki kekerabatan jauh seperti dari kultivar yang berlainan (intraspecific), atau antar species dalam genus yang sama (interspecific), atau fusi antar genus dalam satu famili (intergeneric).

ü Semua gen terlibat dalam proses rekombinasi.

ü Dapat meningkatkan keragaman genetik atau memperbaiki sifat unggul tanaman yang diinginkan.

c.    Jawaban soal c

-     Alasan mengapa embrio rescue perlu dilakukan adalah :

ü Untuk menyelamatkan embrio tanaman yang susah untuk dikembangkan atau yang memungkinkan benih yang belum matang atau embrio diselamatkan untuk membentuk tanaman baru.

ü Karena pada persilangan buatan seringkali dijumpai permasalahan antara lain buah yang terbentuk gugur saat embrio belum matang.

ü Terbentuk buah dengan endosperm yang kecil atau terbentuk buah dengan embrio yang kecil dan lemah.

-     Teknik ini  dapat dilakukan dengan  kultur embrio yang belum matang untuk mencegah keguguran (embrio rescue) atau dengan kultur embrio matang untuk merangsang perkecambahan (embrio culture). Tahapan-tahapan dalam melakukan teknik ini adalah sterilisasi eksplan, isolasi dan penanaman embrio dan tahap aklimatisasi.

-     Contoh kasus kegiatan embrio rescue adalah pada tanaman anggrek, tanaman anggrek mempunyai embrio yang berukuran sangat kecil sehingga tidak memungkinkan untuk dapat berkembang karena hampir tidak ada cadangan makanan yang terdapat didalam biji anggrek tersebut sehingga perlu dilakukan embrio rescue untuk menyelamatkan embrio anggrek.