LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK KULTUR JARINGAN TANAMAN PEMBUATAN MEDIA MS

LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK KULTUR JARINGAN TANAMAN

PEMBUATAN MEDIA MS

OLEH :

MEDIAN EFRADO

E1A006002

PROGRAM STUDI AGRONOMI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BENGKULU

2008

PEMBUATAN MEDIA MS (MURASHIGE & SKOOG)

1.      TINJAUAN PUSTAKA 

Kultur jaringan dalam arti luas berarti menumbuhkan tanaman secara in vitro dari semua bagian tanaman yang dapat berupa sel tunggal, jaringan dan organ dalam kondisi aseptik.  (Torres, 1989). Metodologi in vitro merupakan salah satu teknik penting yang baru dikenal potensinya dalam membantu pemulia tanaman mencapai tujuan perbaikan tanaman, pengembangan kultivar terperbaiki, dan mempelajari lebih jauh tentang keadaan suatu spesies tanaman. Kultur in vitro juga memberikan pengertian tentang studi fisiologi, genetika, biokimia, pertumbuhan, dan perkembangan spesies tanaman pada tingkat molekuler (Nasir, 2002).

Untuk mudahnya teknologi kultur jaringan dapat dibagi kedalam lima kelompok. Pengelompokan tersebut didasarkan pada tipe bahan tanaman yang digunakan, (Gamborg dan Shyluk dalam Thorpe, 1981).

1.      Kultur kalus, adalah kultur dari kumpulan sel yang diproduksi dari eksplan yang berasal dari tanaman pada media agar

2.      Kultur sel, adalah pengkulturan sel pada media cair di dalam bejana .

3.      Kultur organ, adalah kultur aseptik dalam media nutrisi dari ovari, akar, embryo dan organ lainya.

4.      Kultur meristem dan morfogenesis, adalah Kultur aseptik dari tunas meristem atau jaringan eksplan lain yang bertujuan menumbuhkan tanaman utuh.

5.      Kultur protoplas, adalah Isolasi kultur aseptik dari sel atau jaringan tanaman.

Dalam kultur jaringan, media merupakan bagian yang sangat penting dan sangat mempengaruhi keberhasilan kultur. Media kultur yang memenuhi persyaratan ialah media yang mengandung nutrien makro dan mikro dalam kadar dan perbandingan tertentu serta sumber tenaga (umumnya digunakan sukrosa). Sering kali juga mengandung satu atau dua macam vitamin dan zat perangsang pertumbuhan. Banyak formulasi media yang ada, masing-masing berbeda dalam hal kuantitas maupun kualitas komponennya. Salah satu di antaranya adalah media yang diformulasikan oleh Toshio Murashige dan di publikasi oleh Murashige dan Skoog pada tahun 1962. Formulasi dasar MS dapat digunakan untuk sejumlah besar spesies tanaman dalam propagasi in vitro.

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.  Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.  Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.  Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.  Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca.  Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoclave.

Hormon yang ditambahkan dalam media sebagai zat perangsang pertumbuhan adalah auksin dan sitokinin. Peran auksin adalah merangsang pembelahan dan pembesaran sel, sedangkan sitokinin memiliki dua peran yaitu sebagai perangsang pembelahan sel dalam jaringan yang dibuat eksplan, dan merangsang pertumbuhan tunas daun (Gamborg, dan Wetter,  1975).

Selain hormon dan nutrisi, juga ditambahkan zat organik yaitu sukrosa yang digunakan sebagai sumber energi utama dan tiamin adalah tambahan vitamin yang paling penting untuk merangsang pertumbuhan eksplan dan mempertinggi pertumbuhan akar dalam dalam fase-fase akhir. Vitamin C berlaku sebagai anti oksidan dan inositol yang meskipun tidak essensial tetapi dapat merangsang pertumbuhan eksplan (Sharp et al., 1979).

Pemilihan material eksplan   biasanya mengacu pada keobjektifan dan ketersediaan hasil penelitian. Hampir seluruh bagian dari tanaman dapat diinduksi untuk memproduksi kalus dan kultur suspensi. (Gamborg dan Jerri 1981 dalam Thorpe, 1981). Karena kesesuaian suatu bagian tanaman untuk dijadikan eksplan sangat dipengaruhi banyak faktor.

Medium yang dikembangkan oleh Murashige and Skoog (MS) untuk kultur jaringan tembakau digunakan secara luas untuk kultivasi kalus pada agar, demikian juga pada kultur suspensi sel dalam medium cair. Keistimewaan medium MS adalah kandungan nitrat, kalium, dan amoniumnya tinggi. Medium B5 yang dikembangkan di Prairie Regional Laboratory untuk menumbuhkan jaringan kedelai juga berhasil digunakan dalam menumbuhkan sel dari bermacam-macam varietas jaringan tumbuhan.

            Umumnya kadar hara anorganiknya lebih rendah dari pada dalam medium MS, suatu kondisi yang seringkali lebih baik bagi sel spesies tertentu. Baik medium MS maupun medium B5 tampaknya mengandung jumlah hara anorganik yang layak untuk memenuhi kebutuhan banyak jenis sel tanaman dalam kultur.

Banyak sel tidak memerlukan tambahan senyawa organik seperti asam amino, kasein hidrolisat, ekstrak ragi atau air kelapa. Masih banyak medium lain yang dapat digunakan. Umumnya merupakan modifikasi medium tersebut di atas. Medium MS dan B5ternyata baik untuk kultur sel tunggal (protoplas), dan medium M51 merupakan medium paling cocok untuk memulai dan memelihara terutama kultur haploid dari Datura innoxia Mill.

2.      TUJUAN PRAKTIKUM

-        Mahasiswa terampil membuat media kultur jaringan

-        Mahasiswa dapat membuat media kultur sendiri untuk kegiatan praktikum yang sedang dilakukan.

3.      METODELOGI

v  Cara kerja

Setiap kelompok membuat 1 (satu) liter media MS dengan langkah-langkah

1)      Sediakan beacker glass volume 500 ml sebanyak 2 buah, volume 1500 ml 1 buah sediakan 1 buah labu ukur volume 1 liter.

2)      Sediakan aquades sebanyak 2 liter

3)      Timbang sukrosa sebanyak 20 gram

4)      Timbang agar sebanyak 8 gram (1 bungkus agar swallow globe)

5)      Siapkan pipet hisap 0,5 ml 1 buah

6)      Siapkan pipet hisap 5 ml 1 buah

7)      Siapkan bola hisap 2 buah

8)      Siapkan kertas tissue gulung 1 buah

9)      Siapkan aluminium foil 1 gulung, lalu gunting bujur sangkar (besarnya disesuaikan dengan ukuran botol kultur)

10)  Deretkan stok media berdasarkan urutan (A,B,C,D,E,F,H). penambahan vitain dan ZPT akan dibantu oleh Co-Asisten

11)  Pipet stok media dengan pipet hisap (dimulai dari stok A sampai H) sesuai dengan kepekatan yang dibuat, masukkan ke dalam beacker glass yang telah disediakan. (setiap kali memindahkan pipet ke stok lainnya, pipet di cuci dengan aquades dan dikeringkan dengan tisue)

12)  Lakukan pekerjaan poin 11, hingga semua stok telah diambil, setelah itu minta bantuan Co-Asisten untuk menambahkan Vitamin dan ZPT

13)  Setelah semua selesai pada becker glass yang telah membuat semua bahan nutrisi, tambahkan aquades hingga 600 ml, selanjutnya aduk dengan rata dengan menggunakan magnetik stiler hingga larut. Setelah larut tambahkan sukrosa sambil terus diaduk, jkka telah mempercepat kelarutan tambahkan aquades hingga 800 ml sambil terus diaduk, jika telah benar-benar larut pindahkan larutan ke dalam gelas labu 1 liter, selanjutnya tetapkan volume hingga tepat satu liter dengan menambahkan aquades secara perlahan-lahan.

14)  Pindahkan larutan media dari labu ukur ke dalam becker glass volume 1500 ml, tetapkan pHnya menjadi 5,8-6,0 dengan menambahkan larutan HCl atau NaOh, selanjutnya panaskan dengan hot plate magnetik stirrer sambil masukan agar.

15)  Sesaat menjelang titik didih tercapai (larutan berwarna bening dengan sedikit gelembung) pemanasan dihentikan

16)  Pindahkan larutan media ke dalam botol kultur dengan menggunakan agar dispenser sesuai denagan volume yang dibutukan, selanjutnya botol kultur ditutup denagn menggunakan aluminium foil

17)  Media dalam botol kultur distrelisasi dengan autoclave pada suhu 121⁰ C selam 20 menit

18)  Pindahkan botol media kultur ke dalam ruang transfer, setelah satu minggu media dapat digunakan untuk penanaman.

v  Bahan dan Alat

-        Bahan yang digunakan meliputi : stok media MS untuk 1 liter, sukrosa 20 g, Thyamin-HCl 0,5 g, Piridoxsin-HCl 0,5 g, Myo Inositiol 2 g, ZPT Auksin 0,5g. Sitokinin 0,5 g. tissue gulung 1 buah, aluminium foil 1 gulung, agar 10 g, aguades 10 liter. Larutan HCl dan larutan NaOH.

-        Alat-alat yang digunakan meliputi : beacker glass 500 ml, labu ukur 1liter 1 buah, analiticoid balance, gunting, hot plate, magnetik srirer, agar dispenser, botol kultur 100 buah, pipet hisap 0,5 ml 1 buah, pipet hisap 5 ml 1 buah dan bola hisap 2 buah.

4.      PEMBAHASAN

Dalam pembuatan media untuk kultur jaringan tanaman kali ini dibuat berupa media MS (Murashige & Skoog). Jenis media MS ini dipilih karena memang jenis media ini paling sering atau umum dipakai oleh para peneliti untuk melakukan kultur in-vitro. Dalam pembuatannya, diperlukan larutan stok yang telah dibuat pada minggu sebelumnya. Media yang dibuat sebanyak 1 liter dan dapat digunakan menjadi 60-80 botol kultur, tergantung kebutuhan tentunya.

Pembuatan media MS ini menggunakan agar powder sebagai bahan pemadat. Agar yang digunakan seharusnya adalah agar murni. Akan tetapi karena harganya sangat mahal. Maka dapat digantikan dengan agar biasa seperti agar Swallow Globe. Seharusnya bobot agar yang digunakan adalah 8 g, akan tetapi dengan alasan untuk efisiensi kerja, maka digunakan satu bungkus agar Swallow Globe untuk satu kali pembuatan media, karena satu bungkus agar tersebut berbobot 7 g.

Pembuatan media dilakukan dengan mencampur semua larutan stok sesuai konsentrasi yang telah dihitung dengan rumus pengenceran untuk satu liter media, sesuai dengan urutan dari label stok. Hal ini untuk menghindari terjadinya reaksi dan pengendapan dini terhadap media kultur, sehingga dapat mempengaruhi pertumbuhan objek nantinya. Adapun ZPT yang digunakan dalam pembuatan media MS ini adalah BAP 5 ppm dan NAA 2 ppm.

Adapun perhitungan pemipetan masing-masing larutan stok adalah sebagai berikut :

1.      Stok A, BK = 1650 mg

Kepekatan 50 X, Berat BK =

V₁M₁                       =          V₂M₂

1000 V₂

V₂          = 20 mL

2.      Stok B, BK = 1900 mg

Kepekatan 50 X, Berat BK =

V₁M₁                       =          V₂M₂

1000 V₂

V₂          = 20 mL

3.      Stok C, BK = 440 mg

Kepekatan 100 X, Berat BK =

V₁M₁                       =          V₂M₂

1000 V₂

V₂          = 10 mL

4.      Stok D

BK = 370 mg + 170 mg = 540 mg

Kepekatan 100 X, Berat BK =  = 5400 mg

V₁M₁                       =          V₂M₂

1 V₂

V₂          = 10 mL

5.      Stok E

BK = 27,8 mg + 37,3 mg = 65,1 mg

Kepekatan 200 X, Berat BK =  = 13020 mg

V₁M₁                       =          V₂M₂

1000 V₂

V₂          = 5 mL

6.      Stok F

BK = 22,3 + 8,6 + 6,2 + 0,86 + 0,25 + 0,025 + 0,025 = 38,26 mg

Kepekatan 500 X, Berat BK =

 + +  + = 19130 mg

V₁M₁                       =          V₂M₂

1000 V₂

V₂                 = 2 mL

7.      Stok G

BK = 100 mg

Kepekatan 100 X, Berat BK = 100 x 100 = 10000 mg

V₁M₁                       =          V₂M₂

1000 V₂

V₂                 = 10 mL

8.      Stok H

BK = 0,1 + 0,5 + 0,5 + 2 = 3,1 mg

Kepekatan 500 X, Berat BK =

 + = 3100 mg

V₁M₁                       =          V₂M₂

1000 V₂

V₂                 = 1 mL

            Setelah semua bahan dimasukkan, kemudian media di ukur pH dan ditetapkan menjadi 5,8-6,0. Apabila terlalu asam ditambah NaOH dan apabila terlalu basa diberi HCl. Penetapan pH ini dilakukan sebelum dimasukkan agar-agar. Setelah agar dimasukkan, media dimasak dengan Magnetic Stirrer dan Hot Plate. Setelah media mendidih, angkat dan masukkan ke dalam botol kultur secukupnya hingga larutan media habis. Setelah itu masing-masing botol kultur ditutup dengan aluminium foil hingga rapat dan dimaskkan ke dalam autoclave untuk disterilisasi. Sterilisasi dilakukan dengan suhu 121⁰C pada tekanan 15 psi selama 15 menit. Setelah itu, media kultur siap digunakan.

Daftar Pustaka

Asep, Ahyat. 2006. Kultur Jaringan di Sentra Tanaman Hias Cihideung, Lembang, Bandung. http://allbandung.com/articlebandung/media+kultur+jaringan.

Gamborg, O.L., T. Murashige, T.A.Thorpe, dan I.K.Vasil.1976.Plant Tissue Culture Media. In Vitro (12), 473-478

Marlin, Usman. KJS., Atra Romeida. 2008. Penuntun Praktikum Teknik Kultur Jaringan Tanaman. Bengkulu : Laboratorium Agronomi Universitas Bengkulu.

Soeryowinoto, M. 1991. Pemuliaan Tanaman Secara In Vitro. UGM Press, Yogyakarta : Penebar Swadaya, Bandung.

Wetter, L.R., F. Constabel. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman. Bandung : ITB.