LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK KULTUR JARINGAN TANAMAN PEMBUATAN LARUTAN STOK

LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK KULTUR JARINGAN TANAMAN

PEMBUATAN LARUTAN STOK

OLEH :

MEDIAN EFRADO

E1A006002

PROGRAM STUDI AGRONOMI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BENGKULU

2008

PEMBUATAN LARUTAN STOK

1. PENDAHULUAN

Larutan stok dibuat untuk memudahkan pekerjaan dalam pembuatan media selanjutnya antara lain :

1. Menghemat pekerjaan menimbang bahan media setiap kali ingin membuat media

2. Mengatasi kesulitan menimbang dalam jumlah yang sangat kecil

3. Mengurangai kerusakan bahan kimia akibat terlalu sering dibuka dan ditutup

Pembuatan media dikelompokkan berdasarkan jenis bahan kimia yang digunakan, sehingga jika dalam bahan kimia tersebut dicampur tidak terjadi intraksi dan menghasilkan senyawa baru. Biasanya pengelompokkan dilakukan berdasarkan stok hara makro, stok Fe, vitamin dan stok hormon, terutama jika larutan stok tidak disimpan terlalu lama. Stok hara baik mikro maupun makro dapat di simpan dalam waktu yang relatif lama yaitu 4-8 minggu, sedangkan stok hormon hanya baik disimpan untuk waktu 2-4 minggu. Setelah diperoleh larutan stok seperti yang diinginkan,selanjutnya pembuatan media dilakukan dengan mencerminkan larutan stok sesuai dengan kebutuhan yang dikehendaki.

Pembuatan Larutan Stok untuk setiap media dapat berbeda-beda sesuai kebutuhan, unsur yang terkandung, dan tujuan pembuatan larutan stok itu sendiri. Contohnya untuk media Murashige and Skoog (MS) terdapat delapan jenis larutan yang dibuat stok, dan masing-masing memiliki kandungan unsur atau bahan tersendiri yang dilabel A sampai H. Berikut merupakan larutan stok dalam media MS :

1. Stok A : NH₄NO₃

2. Stok B : KNO₃

3. Stok C : CaCl₂ . 2H₂O

4. Stok D : MgSO₄ . 7H₂O

KH₂PO₄

5. Stok E : FeSO₄ . 7H₂O

Na₂EDTA

6. Stok F : MnSO₄ . 4H₂O

ZnSO₄ . 7H₂O

H₃BO₃

Na₂MoO₄ . 2H₂O

CaCl₂ . 6H₂O

CuSO₄ . BH₂O

7. Stok G : Myo Inocytol

8. Stok H : Thiamin

Nicotinic Acid

Pyridoxine

Glycine

Vitamin dan Zat Pengatur Tumbuh semuanya adalah bahan organik. Bahan-bahan organik umumnya peka terhadap cahaya dan suhu tinggi. Disamping itu bahan organik dalam bentuk larutan mudah mengalami perubahan, sehingga tidak mudah awet disimpan lama. Oleh karena itu vitamin dan Zat Pengatur Tumbuh harus disimpan dalam lemari es, sebaiknya membuatnya sedikit saja sehingga cepat habis. Bila vitamin bukan merupakan perlakuan, artinya media menggunakan konsentrasi yang sama, maka larutan vitamin dapat dibuat stok campuran.

► TINJAUAN PUSTAKA

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoclave.

Medium yang dikembangkan oleh Murashige and Skoog (MS) untuk kultur jaringan tembakau digunakan secara luas untuk kultivasi kalus pada agar, demikian juga pada kultur suspensi sel dalam medium cair. Keistimewaan medium MS adalah kandungan nitrat, kalium, dan amoniumnya tinggi. Medium B5 yang dikembangkan di Prairie Regional Laboratory untuk menumbuhkan jaringan kedelai juga berhasil digunakan dalam menumbuhkan sel dari bermacam-macam varietas jaringan tumbuhan.

Umumnya kadar hara anorganiknya lebih rendah dari pada dalam medium MS, suatu kondisi yang seringkali lebih baik bagi sel spesies tertentu. Baik medium MS maupun medium B5 tampaknya mengandung jumlah hara anorganik yang layak untuk memenuhi kebutuhan banyak jenis sel tanaman dalam kultur.

Banyak sel tidak memerlukan tambahan senyawa organik seperti asam amino, kasein hidrolisat, ekstrak ragi atau air kelapa. Masih banyak medium lain yang dapat digunakan. Umumnya merupakan modifikasi medium tersebut di atas. Medium MS dan B5ternyata baik untuk kultur sel tunggal (protoplas), dan medium M51 merupakan medium paling cocok untuk memulai dan memelihara terutama kultur haploid dari Datura innoxia Mill.

Komposisi Medium

1. Garam Organik

Kadar kalium dan nitrat masing-masing sekurang-kurangnya 20-25 mM. amonium mungkin diperlukan juga, walaupun jumlah di atas 8mM dapat membahayakan. Kebutuhan untuk natrium atau klorida tidak nyata. Kadar sulfat, fosfat, dan magnesium 1-3 nM tampaknya sudah mencukupi. Hara mikro yang dianjurkan adalah : iodidad, asam borat, dan garam mangan, seng, molibdenum, tembaga, kobal, dan besi. Yang terakhir ini sebaiknya dipasok sebagai senyawa khelat-nya.

2. Sumber Karbon

Sukrosa atau glukosa 2-4% merupakan sumber karbon yang paling cocok. Berbagai asam organik digunakan bersama amonium yang juga mempercepat pertumbuhan sel yang dikultivasi pada rapatan rendah.

3. Vitamin

Tiamin merupakan satu-satunya vitamin yang penting. Piridoksin, asam nikotinat, dan mio-inositol seringkali dapat meningkatkan pertumbuhan sel. Vitamin lainnya mungkin amat bermanfaat untuk kultur sel tunggal pada rapatan rendah.

4. Pengatur Tumbuh

Pengatur tumbuh dibutuhkan untuk menginduksi pembelahan sel. Senyawa yang paling sering digunakan adalah asam 2,4-D, dan asam NAA. Senyawa ini digunakan dalam kadar 0,1-50 µM. Asam indolasetat menginduksi pembelahan sel, tetapi senyawa ini tidak stabil dan dapat diuraikan oleh enzim yang dibebaskan oleh sel. Asam indolbutirat juga merupakan asam yang ampuh untuk kultur jaringan. Baik 2,4-D maupun NAA amat lambat diuraikan oleh sel tumbuhan, dan stabil dengan pemanasan melalui autoclave. Sitokinin seperti kinetin atau benziladenin (0,1-10 µM) kadang-kadang dibutuhkan bersama 2,4-D atau NAA untuk mendapatkan pembentukan kalus yang baik.

5. Pelengkap Organik

Contohnya misalnya hirolisat protein, ekstrak ragi, ekstrak tetes, dan air kelapa (endosperm cair). Ekstrak ini dapat memasok berbagai senyawa yang dapat merangsang laju pertumbuhan sel, walaupun umumnya sel dapat tumbuh baik, dalam medium tanpa pelengkap ini apabila kadar garam cukup tinggi dan metabolit ditambahkan seperti tertera di atas.

2. TUJUAN PRAKTIKUM

Mahasiswa mampu membuat larutan stok dengan benar.

3. CARA KERJA

· Membuat larutan stok A, 250ml (konsentrasi/kepekatan 50 kali)

1. Timbang persnyawaan NH₄NO₃, sebanyak 20,87 mg

2. Bahan yang telah ditimbang masukkan air bebas ion 7ml, masukkan magnetik stirrer selanjutnya diaduk dengan menggunakan hot plate. Sehingga larut merata, jika berhasil larutan tidak bewarna (bening)

3. Larutan selanjutnya dipidahkan kedalam labu ukur 250 ml yang telah dibilas dengan aquades dan gelas piala dibilas dengan aquades dan air bilasan masukkan kedalam gelas ukur, kemudian kedalam gelas ukur tambahkan air sehingga volume 250 ml.

4. Setelah larutan sudah ditambah dengan air sehingga larutan menjadi 250 ml dan larutan telah jadi, kemudian pindahkan kedalam gelas elenmeyer bertutup ukuran 250 ml dan tutup rapat label larutan “A” kemudian larutan stok disimpan dalam ruang pendingin

5. Alat-alat yang tealh digunakan dibersikan dengan aquades, kemudian semuanya disimpan ditempat penyimpanan alat.

· Membuat larutan stok B 250 ml (konsentrasi /kepekatan 50 kali)

1. Timbang senyawa KNO₃ sebanyak 23,75 mg

2. Bahan yang telah ditimbang masukkan kedalam gelas piala. Selanjutnya diaduk dengan menggunakan hot plate,singga larutan tersebut larut merata

3. Larutkan selanjutnya dipidahkan kedalam labu ukur 250 ml yang telah dibilas dengan aquades dan gelas piala dibilas dengan aquades dan air bilasan masukkan kedalam gelas ukur, kemudian kedalam gelas ukur tambahkan air sehingga volume 250 ml

4. Setelah larutan sudah ditambah dengan air sehingga larutan menjadi 250 ml dan larutan telah jadi, kemudian pindahkan kedalam gelas elenmeyer bertutup ukuran 250 ml dan tutup rapat label larutan “B” kemudian larutan stok disimpan dalam ruang pendingin

5. Alat-alat yang tealh digunakan dibersikan dengan aquades, kemudian semuanya disimpan ditempat penyimpanan alat.

· Membuat larutan stok C 250 ml (konsentrasi /kepekatan 50 kali)

1. Timbang senyawa CaCl₂.2H₂O 11 mg.

2. Bahan yang telah ditimbang masukkan kedalam gelas piala. Selanjutnya diaduk dengan menggunakan hot plate,singga larutan tersebut larut merata

4. Setelah larutan sudah ditambah dengan air sehingga larutan menjadi 250 ml dan larutan telah jadi, kemudian pindahkan kedalam gelas elenmeyer bertutup ukuran 250 ml dan tutup rapat label larutan “C” kemudian larutan stok disimpan dalam ruang pendingin

5. Alat-alat yang tealh digunakan dibersikan dengan aquades, kemudian semuanya disimpan ditempat penyimpanan alat.

· Membuat larutan stok D 250 ml (konsentrasi /kepekatan 100 kali)

1. Timbang senyawa MgSO₄.7H₂O

2. Bahan MgSO₄.7H₂O yang telah ditimbang masukkan air bebas ion secukupnya, masukkan magnetik stirrer selanjutnya diaduk dengan menggunakan hot plate. Sehingga larut merata,

3. Timbang senyawa KH₂PO₄

4. Bahan KH₂PO₄ yang telah ditimbang masukkan air bebas ion secukupnya, masukkan magnetik stirrer selanjutnya diaduk dengan menggunakan hot plate. Sehingga larut merata

5. Kedua larutan selanjutnya dipidahkan kedalam labu ukur 250 ml yang telah dibilas dengan aquades secara berurutan, dan gelas piala dibilas dengan aquades dan air bilasan masukkan kedalam gelas ukur, kemudian kedalam gelas ukur tambahkan air sehingga volume 250 ml

6. Setelah larutan sudah ditambah dengan air sehingga larutan menjadi 250 ml dan larutan telah jadi, kemudian pindahkan kedalam gelas elenmeyer bertutup ukuran 250 ml dan tutup rapat label larutan “D” kemudian larutan stok disimpan dalam ruang pendingin

7. Alat-alat yang tealh digunakan dibersikan dengan aquades, kemudian semuanya disimpan ditempat penyimpanan alat.

· Membuat larutan stok E 100 ml (konsentrasi /kepekatan 200 kali)

1. Timbang senyawa FeSO₄.7H₂O 1,8 mg

2. Bahan FeSO₄.7H₂O yang telah ditimbang masukkan air bebas ion secukupnya, masukkan magnetik stirrer selanjutnya diaduk dengan menggunakan hot plate. Sehingga larut merata,

3. Timbang senyawa Na₂EDTA 1,75 mg

4. Bahan Na₂EDTA yang telah ditimbang masukkan air bebas ion secukupnya, masukkan magnetik stirrer selanjutnya diaduk dengan menggunakan hot plate. Sehingga larut merata

6. Setelah larutan sudah ditambah dengan air sehingga larutan menjadi 250 ml dan larutan telah jadi, kemudian pindahkan kedalam gelas elenmeyer bertutup ukuran 250 ml dan tutup rapat label larutan “E” kemudian larutan stok disimpan dalam ruang pendingin

7. Alat-alat yang tealh digunakan dibersikan dengan aquades, kemudian semuanya disimpan ditempat penyimpanan alat.

· Membuat larutan stok F 100 ml (konsentrasi /kepekatan 200 kali)

1. Timbang bahan-bahan sumber hara mikro dengan menggunakan timbangan sebagai berikut :

1) MnSO.H₂O (2,7873 mg)

2) MgSO₄.7H₂O (1,075 mg)

3) H3BO₃(0,775 mg)

4) KI (0,0375 mg)

5) Na₂MoO₄.2H₂O (0,03125 mg)

6) CoCl_2.6H₂O (0,003125 mg)

7) CuSO₄.5H₂ (0,003125 mg)

2. Bahan yang telah ditimbang masukkan kedalam gelas piala bersih yang telah berisi aquades atau air bebas ion 30-40 ml secara terpisah. Selanjutnya diaduk hingga merata, jika berhasil larutan tidak berwarna (bening).

3. Larutan selanjutnya disatukan dengan cara menuangkan kedua larutan ke dalam gelas ukur 250 ml yang telah dibilas dengan aquades. Gelas piala dibilas dengan aquades dan bilasan air dimasukkan kedalam gelas ukur. Kemudian didalam gelas ukur tambahkan air sebanyak 250 ml

4. Larutan yang telah jadi masukkan kedalam elenmenyer tertutup 250 ml dan tutup rapat dengan menggunakan aluminium foil dan beri label stok “F”, selanjutnya larutan stok disimpan di dalam ruang pendingan

5. Alat-alat yang telah digunakan dibersikan dengan aquades, selanjutnya semuanya disimpan ditempat penyimpanan alat.

4. Hasil Pembuatan Larutan Stok A-F 250 mL

Kode Stok	Bahan Kimia	Berat BK mg Larutan Stok	Kepekatan Larutan Stok	Volume Pemipetan Stok
A	NH₄NO₃	20,87	50 X	0,02 mL
B	KNO₃	23,75	50 X	0,02 mL
C	CaCl₂.2H₂O	11,00	50 X	0,02 mL
D	1) MgSO₄.7H₂O 2) KH₂PO₄		100 X	0,01 mL
E	1) FeSO₄.7H₂O 2) Na₂EDTA	1,8 1,75	200 X	0,005 mL
F	1) MnSO.H₂O 2) MgSO₄.7H₂O 3) H3BO₃ 4) KI 5) Na₂MoO₄.2H₂O 6) CoCl_2.6H₂O 7) CuSO₄.5H₂O	2,7873 1,075 0,775 0,0375 0,03125 0,003125 0,003125	200 X	0,008 mL