PEMBUATAN MEDIA

ACARA V

“PEMBUATAN MEDIA”

sumber foto = wisudaunib.ac.id

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Media kultur jaringan merupakan salah satu faktor yang dapat menentukan tingkat keberhasilan paebanyakan tanaman secara invitro, dalam hal ini adalah kultur jaringan. Berbagai formulasi atau komposisi media tanam telah banyak ditemukan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan.

Dari sekian banyak permasalahan yang harus diteliti dan diperhatikan, komposisi media bagi pertumbuhan eksplan adalah yang paling banyak diteliti dan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, macam – macam media kultur jaringan telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hamper sama , hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap – tiap persenyawaan. Medium yang digunakan untuk alas makan mengandung garam – garam mineral yang terdiri dari unsure – unsure makro dan mikro, sumber karbon, vitamin, asam – asam amino, zpt, bahan organic kompleks dan sebagainya.

Pembuatan media kultur pada prinsipnya dilakukan dengan cara melerutkan semua komponen media di dalam air sesuai dengan konsentrasi masing-masing formulasi media yang digunakan. Kelengkapan komponen penyusun dan tingkat sterilitas media sangat berpangaruh terhadap penggunaan media dalam proses pengkulturan nantinya.

Melihat peranan penting dari media kultur, maka melaui praktikum ini dilakukan pembuatan media kultur secar baik dan benar sesuai dengan prosedur yang ada.

1.2  Tujuan

Ø  Agar mahasiswa terampil dalam membuat media kultur

Ø  Agar mahasiswa dapat membuat media kultur sendiri untuk praktikum yang sedang dilakukan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Kultur in vitro atau kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. Kultur jaringan memiliki beberapa tujuan, diantaranya menciptakan tanaman baru bebas penyakit, memperbanyak tanaman yang sukar diperbanyak secara seksual, dan menghasilkan tanaman baru sepanjang tahun.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan dalam kultur in vitro, diantaranya: faktor genetik, media tumbuh, faktor lingkungan, dan zat pengatur tumbuh.

Menurut Wattimena (1992) zat pengatur tumbuh (ZPT) di dalam tanaman mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman pada setiap tingkat pertumbuhan dan perkembangan. Di dalam tanaman terdapat fitohormon yang mendorong pertumbuhan dan perkembangan, serta fitohormon yang menghambat. ZPT akan bekerja secara aditif (sinergis) dengan fitohormon (pendorong) atau antagonis dengan fitohormon yang menghambat. Resultan dari interaksi ini akan tampil dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Menurut Gunawan (1992) tanaman pada kultur jaringan tidak dapat menghasilkan karbohidrat sendiri dalam jumlah cukup sehingga perlu diberikan sumber energi karbon dalam media.

Media yang digunakan untuk pengumbian adalah satu macam media (padat atau cair) dan dua macam media (padat-cair atau cair-cair, yang dianjurkan adalah sistem cair-cair. Hasil penelitian Wattimena (1983) menunjukkan bahwa media cair untuk pengumbian secara in vitro akan menghasilkan umbi dengan ukuran, bobot basah, dan persentase bahan kering yang lebih tinggi daripada penggunaan media padat.

Dalam prosesnya, keberhasilan kultur jaringan selain dikarenakan oleh kondisi lingkungan  yang terkendali juga ditentikan oleh media kultur. Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan. Media kultur merupakan komponen faktor lingkungan  yang menyediakan unsure pertumbuhan tanaman seperti unsure hara makro, unsure hara mikro, karbohidrat, vitamin dan zat pengatur tumbuh, param-garam organic, persenyawaan komplek alamiah, arang aktif dan bahan pemadat (George and Sherington, 1984).

Ketersediaan media kultur dalam kaitannya dengan kultur jaringan terdapat dalam berbagi bentuk dan formulasi, hal ini dimaksudkan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Media kultur secara fisik dapat dibedakan menjadi media cair dan media padat., pada media pemadat menggunakan bahan pemadat berupa agar. Adapun berbagai formulasi media kultur antara lain : Knudson, Heller, Nitsch dan Nisch, Gambong dan MS (Murashige and Skoog).

Media kultur yang biasa digunakan adalah media dengan formulasi Murashige and Skoog (MS). Media MS merupakan media dasar yang mempunyai formulasi yang sangat lengkap. Komposisi media MS ini pada umumnya dapat digunakan pada hampir semua jenis tanaman (Wattimena,1992).

Media invitro yang biasa digunakan biasa berupa media padat sebab memiliki beberapa keuntungan antara lain:

1. Penggunaan eksplan terkecil akan lebih muda terlihat
2. Eksplan berad di atas permukaan media sehingga tidak perlu memerlukan alat Bantu untuk aerasi
3. Tunas dan akar akn lebih muda tumbuh pada media yang diam. (George and Sherington,1984)

Namun pada media cair juga terdapat beberapa keuntungan yang tidak dimiliki pada media padat yaitu antara lain :

1. Tidak memerlukan tambahan bahan pemadat
2. Tepat untuk proses kultur protoplasma maupun kultur sel

3.Eksudat yang dikeluarkan oleh eksplan tidak terakumulasi disekitar eksplan

4. Kontak ekslan dengan media lebih besar  (George and Sherington, 1984)

Adapun komponen-komponen penyusun media kultur antara lain :

1. Air destilata

Air destilata merupakan air bebas ion yang berfungsi sebagai pelarut atau solven. Air pada media kultur merupakan komponen utama yaitu berkisar sekitar 95%.

2. Hara makro dan hara mikro

Kebutuhan nutrisi mineral untuk tanaman yang dikulturkan secara invitro pada dasarnya sama dengan kebutuhan hara tanaman yang tumnuh di tanah yaitu meliputi hara makro dan hara mikro. Unsur hara pada kultur jaringan biasanya berbentuk garam-garam yang biasanya dilarutkan terlebih dahulu. Khusus untuk Fe biasanya diberikan dalam bentuk FeSO4, dibutuhkan agen pengkhelat yang berupa Na2EDTA.

3. Gula

Gula digunakan sebagi sumber energi oleh eksplan untuk dapat tumbuh di dalam media kultur sebab pada media kultur ekspaln mempunyai laju fotosintesis yang rendah sehingga energi yang dihasilkan sedikit. Gula yang paling sring digunakan sebagi komponen media kultur dalah sukrosa.

4.Vitamin dan bahan organik lain

Vitamin, asam amino dan bahan organic lain seperti myo inositol merupakan komponen media yang berpengaruh baik terhadap pertumbuhan kultur. Kelompok vitamin yang sering digunakan dalah dari golongan vitamin B yaitu Thiamin-HCL (B1), Pyrodoxin-HCL (B6), ASAN Nikotinat dan Riboflavin (B2).

5. Bahan-bahan suplemen alami

Bahan-bahan suplemen alami seperti jus tomat, jus jeruk, air kelapa, ekstrak malt, ekstrak ragi, kentang dan bubur pisang kadang-kadang digunakan sebagai penambah media terutama jika zat-zat yang suda teridentifikasi belum dirasa cukup untuk pertumbuhan eksplan.

6. Zat pengatur tumbuh (ZPT)

Salah satu komponen yang juga menentukan keberhasilan kultur jaringan adalah jenis dan konsentrasi ZPT yang digunakan Jenis dan konsentrasi ZPT yang digunakan tergantung pada tujuan dan tahap pengkulturan. Pengakulturan untuk merangsang pembentukan akar biasanya menggunakan ZPT Auksin. Jenis auksi yang sering digunakan adalah IBA dan NAA.

7. Bahan pemadat

Pemadat diguanakan untuk media kultur dalam bentuk padat. Pemadat yang sering digunakan adalah agar. Agar adalah campuran dari berbagi polisakarida dan galaktosa yang diekstrak dari ganggang laut (Nugroho, 1997).

BAB III

METODOLOGI

3.1 Bahan dan Alat                            

1. Stok media MS untuk 1 liter                 8. Alumunium foil 1 gulung

2. Sukrosa 20 g                                         9. Agar 10 g

3. Thyamin-HCL 0.5 g                              10. Aquades 10 L                                          

4. Piridoxin-HCL 0.5 g                             11. Larutan HCL                   

5. Myo inositol 2 g                                    12. Larutan NAOH                            

6. ZPT Auksin 0.5 g                                  13. Tissue gulung 1 gulung

7. Sitokinin 0.5 g

3.2 Cara Kerja

         1. Menyediakan Beacker glass volume 500 ml sebanyak 2 buah, volume 1500 ml sebanyak 1 buah dan labu ukur volume 1 liter 1 buah.

2. Menyediakan aquades sebanyak 2 Liter.

3. Menimbang sukrosa sebanyak 20 g

4. Menimbang agar sebanyak 8 g

5. Menyiapkan pipet hisap 0.5 ml sebanyak 1 buah

6. Menyiapkan pipet hisap 5 ml sebanyak 1 buah

7. Menyiapkan bola hisap 2 buah

8. Menyiapkan kertas tissue gulung 2 buah

9. Menyiapkan alumunium foi 1 gulung, lalu dilakukan pengguntingan berbentuk bujur sangkar sesuai dengan ukuran botol kultur

10. Menderetkan stok media berdasarkan urutan (A, B, C, D, E, F, G), proses penambahan ZPT dibantu oleh co-asisten

11. Memipet stok media dengan pipet hisap yang dmulai dari stok A, B, dst sesuai dengan kepekatan yang dibuat, memasukkan larutan stok tersebut ke dalam beacker glass yang telah disediakan (setiap kai memindahkan larutan stok, pipet dicuci dengan aquades dan dikeringkan dengan menggunakan tissue)

12. Melakukan pekerjaan pada point 11, sehingga semua larutan stok terambil. Untuk penambahan ZPT dibantu oleh co-asisten

13. Menambahkan aquades 600 ml setelah semua selesai pada beacker glass yang telah memuat semua bahan nutrisi, kemudian melakukan pengadukan dengan menggunakan magnetic stearer hingga larut. Menambahkan sukrosa sambil terus diaduk . Untuk mempercepat kelarutan sukrosa maka dilakukan penambahan aquades hingga volume larutan mencapai 800 ml. Jika larutan sudah benar-benar homogen maka dilakukan pemindahan larutab ke dalam labu ukur volume 1 liter., Selanjutnya tepatkan volumenya hingga tepat 1 liter dengan menambahkan aquades secara perlahan-lahan.

14. Memindahkan larutan media dari labu ukur ke dalam beacker glass volume 1500 ml. kemudian menetapkan ph dengan kisara 5.8-6.0 dengan menambahkan HCL atau NAOH, selanjutnya memanaskan dengan menggunakan hot plate magnetic stearer sambil dilakukan penambhan agar

15. Menjelang titik didih tercapai (Larutan berwarna bening dengan sedikit gelembung) pemanasan dihentikan.

16. Memindahkan larutan media ke dalam botol kultur dengan menggunakan dispenser sesuai denhan volume yang dibutuhkan, selanjutnya menutup botol kultur dengan alumunium foil.

17. Melakukan sterilisasi media di dalam botol kultur dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 derjat celcius selam 15 menit

18. Memindahkan botol kultur ke dalam ruang transfer, setelah 1 minggu media kultur dapat digunakan untuk penanaman.

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Larutan stok	Kebutuhan untuk media ms
A	20 ml
B	20 ml
C	10 ml
D	10 ml
E	5 ml
F	2 ml
G	10 ml
H	1 ml
Myo Inositol	10 ml
NAA	3 ppm
BAP	5 ppm
Agar	8 g

4.1  Pembahasan

Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat bergantung pada media yang digunakan. Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan. Media kultur merupakan komponen faktor lingkungan  yang menyediakan unsure pertumbuhan tanaman seperti unsure hara makro, unsure hara mikro, karbohidrat, vitamin dan zat pengatur tumbuh, param-garam organic, persenyawaan komplek alamiah, arang aktif dan bahan pemadat. Pada parakikum ini media kultur yang dibuat yaitu dalam bentuk padat dengan formulsi Murashige dan Skoog.

Pembuatan media kultur dilakukan dengan cara memipet larutan stok yang sebelumnya sudah dibuat dan disimpan di lemari pendingin. Larutan stok tersebut dipipet sesuai dengan hasil pencarian (pada 4.2 Perhitungan) dengan menggunakan rumus pengenceran kemudian diencerkan (yang sebelumnya terlebih dahulu telah dideretkan di atas meja secara berurutan mulai dari larutan stok A-H) ke dalam gelas piala berukuran 1L. Pemipetan dilakukan secara berurutan untuk menghindari terjadi reaksi kimia antar larutan yang dapat menyebabkan penurunan atau degradasi maupun reaksi penggaraman yang akan berakibat pada ketidaktersediaa unsur tumbuh untuk petumbuhan eksplan. Konsentrasi larutan yang digunakan sesuai dengan konsentrasi pada formulasi media MS. Larutan yang telah berada didalam beacker gelas kemudian diencerkan dengan ditambah air sebanyak 800 ml dulu dan sukrosa sebanyak 20 g. Gula berfungsi ganda di dalam media yaitu berfungsi sebagai sumber energi, dan sebagai penyeimbang tekanan osmotik media. Kemudian dipanaskan dengan menggunakan hot plate magnetic stearer. Hal tersebut dilakukan supaya sukrosa cepat larut. Setelah sukrosa larut kemudian larutan tersebut baru ditambahkan air sampai volumenya menjadi 1 L, pemanasan tetap terus dilakukan. Kemudian kita mengukur pH larutan menggunakan pH meter. pH larutan yang dianjurkan adalah berkisar anatara 5,8-6,0. Apabila pH larutan di bawah 5,8 maka dilakukan penambahan NaOH setetes demi setetes sampai pH naik sekitar 5.8. Apabila pH di atas 6.0 maka dilakukan penambahan KCl setetes demi setetes sampai pH turun pada kisaran tersebut. Sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5.5-5.8. Sekalipun media sudah ditetapkan, seringkali setelah sterilisasi pH-nya berubah.

Untuk menghindarkan perubahan pH yang cukup besar Murashige dan Skoog menyarankan agar dilakukan pemanasan untuk melarutkan agar-agar dan memanaskan media didalam autoklaf selama beberapa menit, baru diadakan penetapan media disterilkan dalam autoklaf. Dalam wadah yang besar, media disterlikan dan kemudian dititrasi dengan NaOH/HCl steril sampai pH yang diinginkan. Setelah itu media dituang ke dalam wadah kultur steril yang telah dipersiapkan di dalam laminar air flow cabinet.

Pada praktikum yang kami lakukan penambahan NaOH pada larutan sebab pH larutan berda di bawah kisaran pH yang dianjurkan yaitu sebesar 5,6 karena bahan pembuat medianya kebanyakan golongan asam. Kemudian dilakukan pengukuran pH dan ditetapkan sampai 5.8. Pengaturan pH dilkukan untuk menjamin ketersediaan unsure hara bagi eksplan di dalam botol kultur. Setelah ditambahkan NaOH pH menjadi 5.8, maka setelah itu baru dimasukan agar. Karena pada praktikum ini, media yang digunakan adalah media padat maka diperlukan bahan pemadat berupa agar. Agar yang diberikan yaitu sebesar 7 gram dimasukkan kedalam larutan penyusun media dan dipanaskan.

BAB VI

PENUTUP

Kesimpulan:

Dari praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa pembuatan media haruslah hati – hati dan sesuai dengan prosedur yang ada karena pembuatan media yang benar menentukkan tingkat keberhasilan kultur jaringan. Selain itu media kultur jaringan juga harus disterilkan terlebih dahulu sebelum digunakan supaya media tanamnya tidak terkontaminasi dari kuman – kuman dari luar. dan media tanam yang digunakan dalam praktikum ini yaitu  Murashige and Skoog (MS)

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2010. Kultur jaringan. http://kulturjaringangue.blogspot.com/. di akses 12 april 2013.

Anonim. 2012. Sterilisasi alat-alat kultur jaringan. http://ayatersenyum.blogspot.com/2012/06/sterilisasi-alat-alat-kultur-jaringan.html. di akses 12 april 2013.

Anonim. 2013. Laboratorium kultur jaringan. http://lensa-alam-dan-dunia.blogspot.com/2013/04/laboratorium-kultur-jaringan.html. di akses 12 april 2013.

Budisma. 2013. Langkah-langkah teknik kultur jaringan. http://budisma.web.id/materi/sma/kelas-xi-biologi/langkah-langkah-teknik-kultur-jaringan/. di akses 12 april 2013.

Daisy, Hendaryono,Sriyanti dan Wijayanti. 2006. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta.

Daisy, Hendaryono,Sriyanti, Wijayanti. 1994. Tehnik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta.

George, E. T and P. O. Sherington. 1984. Plant Popagation by Tissue Culture Handbook And Directory Comercil Collaboration. Exogetis Ltd, England..

Nugroho, A dan H. Sugianto. 1997. Pedoman Pelaksanaan Tehnik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya, Jakarta.

Sentra edukasi. 2011. Kultur jaringan tumbuhan. http://www.sentra-edukasi.com/2011/06/teknik-kultur-jaringan-tumbuhan.html. di akses 12 april 2013.

Sriyanti. 1994, Tehnik Kultur Jaringan. Penerbit Kanisius, Yogyakarta.

Tim pembimbing praktikum. 2013. Penuntun Praktikum Kultur Jaringan. Fakultas Pertanian. Universitas Bengkulu, Bengkulu.

Wattimena, G. A. 1992. Bioteknologi Tanaman. IPB, Bogor.

Wikipedia. 2013. Kultur jaringan. http://id.wikipedia.org/wiki/Kultur_jaringan. di akses 12 april 2013.

Yusnita, 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien. P.T Agromedia Pustaka, Tangerang.