M HASYBI IZZADIN (E1G014049) LAPORAN PRAKTIKUM DAN KARYA TULIS FAKULTAS PERTANIAN (UNIB)

ACARA III

“STERILISASI RUANG, ALAT DAN MEDIA KULTUR”

sumber foto = unibwisuda.ac.id

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

            Salah satu faktor pembatas dalam kebersihan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Sterilisasi dalam kultur jaringan ada 3 tahap yaitu :

1.      Sterilisasi lingkungan kerja

Lingkungan kerja untuk teknik kultur jaringan dapat dibagi atas lingkungan umum dan lingkungan spesifik. Lingkungan umum adalah ruangan transfer secara keseluruhan, sedangkan lingkungan spesifik adalah lingkungan didalam laminar air flow cabinet dimana proses penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma dilakukan.

2.      Sterilisasi alat-alat dan media

Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel.

Media dan aquades juga disterilkan dalam autoclave. Untuk aquades sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya elemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoclave pada suhu 121⁰C. 

3.      Sterilisasi bahan tanaman

Pada setiap jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri. Bakteri-bakteri ini sampai sekarang belum diidentifikasi. Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida yang sistemik.

1.2 Tujuan

            Memberikan pengetahuan dan ketrampilan pada mahasiswa agar terampil melakukan sterilisasi ruang, peralatan dan media yang diguanakan dalam kultur jaringan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Setiap langkah yang digunakan dalam perbanyakan in vitro dalam kondisi aseptik. Alat yang digunakann harus steril dimulai sebelum kegiatan kultur jaringan berjalan. Sterilisasi alat bertujuan untuk membebaskan alat dari berbagai mikroba termasuk spora.

Semua alat yang digunakan dalam kultur jaringan, harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit (Anonim, 2012).

            Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah : pinset, gunting, gagang scalpel, kertas saring, petri dish, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah 121⁰ C pada tekanan 17,5 psi (pounds per squareinch) selama 1 jam. Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.

Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan dapat disterilisasikan dalam autoclave. Alat tanam seperti : pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan, namun pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam suhu tinggi, oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit (Sriyanti, 1994).

Pada prinsipnya, peralatan yang digunakan dalam praktikum ini haruslah steril. Karena peralatan yang tidak steril akan dapat menjadi sumber kontaminan sehingga menggagalkan percobaan kultur jaringan yang dilakukan.

Selain peralatan seperti : pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel, media dan aquades dan ruanangan yang digunakan juga harus disterilisasi (Anonim, 2010).

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

Bahan dan Alat

• Autoklaf
• Peralatan kaca/glass ware (botol kultur, petridish,Erlenmeyer)
• Peralatan penanaman / dissesting kit (piset, gunting, scalpel)
• Plastic, karet gelang, kertas pembungkus, alumunium foil, plastic seal
• Bahan kimia formalin

Cara kerja

v  Sterilisasi lingkungan kerja

Kebersihan lingkungan kerja secara keseluruhan dilakukan dengan cara membersihkan semua debu dan kotoran. Selanjutnya dilakukan kegiatan fumigasi dengan menggunakan disinfektan atau senyawa formalin yang dilakukan secara priodik. Pada ruang transfer biasanya dilengkapi dengan laminar air flow cabinet (LAC). Proses transfer atau penanaman eksplan dilakukan dengan aseptic didalam LAC karena dilengkapi dengan

1.      Filter HEPA ( high efficiency particulate air )

2.      Ultraviolet lamp (UV lamp)

3.      Blower

v  Sterilisasi air dan media tanam

1.      Botol yang telah diisi dengan air dan botol kultur yang telah berisi media kultur ditutup rapat dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 selama 15 menit pada tekanan 15 psi (pound per square inch )

2.      Selama proses sterelisasi berlangsung, autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoclave naik.

3.      Setelah proses sterilisasi selesai, suhu dan tekanan autoclave kembali keposisi 0, keluarkan botol kultur dari dalam autoclave .

4.      Inkubasi didalam ruang kultur selama ± 1 minggu.

v  Sterilisasi botol kultur yang terkontaminasi

1.      Botol kultur yang terkontaminasi dikeluarkan dari ruang kultur

2.      Sterilisasi langsung dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 selama 30 menit pada tekanan 15 psi

3.      Selama proses sterilisasi berlangsung, autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoclave naik

4.      Setelah proses sterilisasi selesai , suhu dan tekanan autoclave kembali keposisi 0, keluarkan botol kultur dari dalam autoclave

5.      Buang semua sisa media yang terkontaminasi pada tempat yang sudah disiapkan

6.      Rendam kedalam larutan sodium hypochorite (dapat menggunakan beclin) dengan konsentrasi 50 % selama minimal 1 jam

7.      Cuci dengan deterjen

8.      Bilas dengan air bersih yang mengalir

9.      Tempatkan didalam oven pada suhu 70 – 80 , atau simpan kembali ditempat yang bersih

v  Sterilisasi glass ware dan dissecting kit

1.      Cuci bersih glass ware dan dissecting kit yang akan disterilisasikan

2.      Bungkus glass ware dan dissecting kit dengan menggunakan alumunium foil atau kertas yang bersih

3.      Autoclave pada suhu 121  pada tekanan 15 psi selama 30 menit

4.      Setelah proses sterilisasi selesai, suhu dan tekanan autoclave kembali keposisi 0, alat alat dari autoclave

5.      Simpan dalam oven atau dalam laminar air flow cabinet dengan posisi lampu UV tetap menyala.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

·         Jenis sterilisasi yang dilakukan

·         Sterilisasi lingkungan kerja

·         Sterilisasi air dan media tanam

·         Strilisasi botol kultur yang terkontaminasi

·         Sterilisasi glass were dan dissecting kit

·         Prosedur pelaksanaan sterilisasi ruang

·         Membersihkan semua debu dan kotoran yang ada

·         Melakukan fumigasi dengan disinfektan ataupun senyawa formalin secara priodik

·         Bahan kimia yang dapt digunakan untuk sterilisasi ruang

·         Disinfektan atau senyawa formalin

·         Prosedur pelaksanaan sterilisasi alat

1)      Cuci bersih alat yang digunakan ( gunting, pinset, glass were, dissecting kit )

2)      Bungkus alat alat trersebut dengan menggunakan kertas alumunium foil atau kertas yang bersih

3)      Kemudian autoclave pada suhu 121   dengan tekanan 15 psi selama 30 menit

4)      Setelah selesai pastikan suhu dan tekanan autoclave keposisi 0 (nol )

5)      Simpan dalam oven  / laminar air flow

·         Alat yang digunakan untuk proses srelissi , waktu, suhu dan tekanan yang digunakan

·         Autoclave

·         Autoclave merupakan alat yang digunakan dalam sterilisasi alat dan media. Sterilisasi air dan media tanam dilakukan dengan suhu 121  , selama 15 menit pada tekanan 15 psi. Sterilisasi botol kultur yang terkonaminasi dilakukan dengan suhu 121  , selama 30 menit pada tekanan 15 psi. Sterilisasi glass were dan dissecting kit dilakukan dengan suhu 121  , selama 30 menit pada tekanan 15 psi.

·         Prosedur pelaksanaan sterilisasi media dan air

1)      Botol yang telah berisi air dan botol kultur yang berisi media kultur ditutup rapat dengan alumunium foil dan disterilisasikan dengan autoclave dengan rapat pada suhu 121  dengan tekanan 15 psi selama 15 menit

2)      Setelah selesai suhu autovlave diturunkan kembali hingga nol

3)      Setelah suhu dingin keluarkan botol kurtul dari autoclave

4)      Kemudian inkubasi dalam ruang kultur selama ± 1 minggu atau bila sudah dingin bisa langsung kita pakai.

BAB V

PENUTUP

Kesimpulan:

·         Sterilisasi alat dan media merupakan syarat mutlak suksesnya kultur jarngan tanaman, dilakukan dengan menggunakan autoclave. Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi.

·         Jenis jenis sterilisasi yang dilakuakan dalam kultur jaringan yaittu sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi air dan media tanam, sterilisasi botol kultur yang terkontaminasi dan strilisasi glass were dan dissecting kit.

·         Autoclave merupakan alat yang digunakan dalam sterilisasi alat dan media. Sterilisasi air dan media tanam dilakukan dengan suhu 121  , selama 15 menit pada tekanan 15 psi. Sterilisasi botol kultur yang terkonaminasi dilakukan dengan suhu 121  , selama 30 menit pada tekanan 15 psi. Sterilisasi glass were dan dissecting kit dilakukan dengan suhu 121  , selama 30 menit pada tekanan 15 psi.

·          Sterilisasi ruang kerja dapat dilakukan dengan cara membershkan semua debu dan kotoran yang ada, selanjutnya dilakukan kegiatan fumigasi dengan menggunakan disinfektan ataupun senyawa formalin yang dikakukan secara priodik.